葉綠素廣泛存在于果蔬等高等綠色植物中，與蛋白質(zhì)結(jié)合成葉綠體。高等植物中葉綠素有兩種：葉綠素a和葉綠素b。這兩種葉綠素都溶于乙醇、乙醚、丙酮等有機(jī)物。葉綠素是綠色植物進(jìn)行光合作用的必需因子，在光合作用中起到吸收和傳遞光能的作用。其中葉綠素a的分子式為C40H70O5N4Mg，葉綠素a的分子結(jié)構(gòu)由4個(gè)吡咯環(huán)通過4個(gè)甲烯基（=CH—）連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，稱為卟啉（環(huán)上有側(cè)鏈）。卟啉環(huán)中央結(jié)合著1個(gè)鎂原子，并有一環(huán)戊酮（Ⅴ），在環(huán)Ⅳ上的丙酸被葉綠醇（C20H39OH）酯化、皂化后形成鉀鹽具水溶性。在酸性環(huán)境中，卟啉環(huán)中的鎂可被H取代，稱為去鎂葉綠素，呈褐色，當(dāng)用銅或鋅取代H，其顏色又變?yōu)榫G色，此種色素穩(wěn)定，在光下不退色，也不為酸所破壞，浸制植物標(biāo)本的保存，就是利用此特性。

利用分光光度計(jì)進(jìn)行葉綠素a的測(cè)定，是最普通的測(cè)量葉綠素a的方法。利用分光光度計(jì)，首先測(cè)定葉綠素提取液在最大吸收波長(zhǎng)下的吸光值，葉綠素a在645nm和665nm處有最大的吸光值。然后利用朗伯—比爾定律計(jì)算出提取液中各色素的含量。朗伯—比爾定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式為A=lg(1/T)=Kbc ，其中A為吸光度；T為透射比,是投射光強(qiáng)度比上入射光強(qiáng)度；c為吸光物質(zhì)的濃度；b為吸收層厚度。

葉綠素a的測(cè)定過程

首先介紹下我們?cè)跍y(cè)定過程中要用到的儀器：分光光度計(jì)、天平、研缽、棕色容量瓶、小漏斗、定量濾紙、吸水紙、擦境紙、滴管；準(zhǔn)備幾片新鮮的植物葉片；準(zhǔn)備96%的乙醇（或80％丙酮）、石英砂和碳酸鈣粉。

然后具體操作如下：取新鮮植物葉片(或其它綠色組織)或干材料，擦凈組織表面污物，去除中脈剪碎。稱取剪碎的新鮮樣品2g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及3mL95％乙醇，研成均漿，再加乙醇10mL，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3～5min。取濾紙1張置于漏斗中，用乙醇濕潤(rùn)，沿玻棒把提取液倒入漏斗，濾液流至100mL 棕色容量瓶中；用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)�一起倒入漏斗中。用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘?jiān)�中無(wú)綠色為止。最后用乙醇定容至100mL，搖勻。取葉綠體色素提取液在波長(zhǎng)665nm、645nm 和652nm下測(cè)定吸光度，以95％乙醇為空白對(duì)照。

然后根據(jù)資料上提供的葉綠素a的計(jì)算方法，就可算出新鮮的植物葉片葉綠素a的含量。具體公式如下：

葉綠素a=（12.7A₆₆₅-2.69A₆₄₅）*(V/1000W)

葉綠素b=（12.7A₆₄₅-2.69A₆₆₅）*(V/1000W)

總?cè)~綠素a=（20.0A₆₄₅+8.02A₆₆₅）*(V/1000W)  或者總?cè)~綠素a=（A₆₅₂/34.5）*(V/1000W)

圖 分光光度計(jì)

另一種葉綠素a的測(cè)定方法—熒光光度法

近年來(lái)，海水葉綠素a含量測(cè)定的分光光度法已逐漸被較簡(jiǎn)便且靈敏度高的萃取熒光法代替。其原理是葉綠素a的丙酮萃取液受藍(lán)光激發(fā)后產(chǎn)生紅色熒光，用熒光計(jì)在波長(zhǎng)670nm測(cè)定提取液酸化前后的熒光值，按下式計(jì)算海水葉綠素a的含量：

             （1）

式中，Rb—酸化前熒光值；Ra—酸化后熒光值；R—純?nèi)~綠素a的酸化因子(隨儀器而異）。因 ，故（1）式成為：

                               （2）

式中， Fd—測(cè)定時(shí)熒光計(jì)所用量程的換算因子(mg/m3)，其值的確定有幾種方法，具體介紹如下：

⑴標(biāo)準(zhǔn)葉綠素a校正法：用純?nèi)~綠素a配成母液，把母液稀釋成一系列不同濃度的溶液并分別測(cè)定熒光讀數(shù)，最后用直線回歸法算出標(biāo)定線的斜率，即Fd。

⑵分光光度計(jì)校正法：取一定體積處于指數(shù)生長(zhǎng)期的單細(xì)胞藻類，按分光光度法測(cè)定葉綠素a的方法，測(cè)其吸光值E，按公式chl-a = 11.85E664－1.54 E647－0.08 E630 ＝C_chl-a計(jì)算該提取液的Cchl-a。然后將它在熒光計(jì)上測(cè)定熒光值Rb，按（3）式求得Fd。本實(shí)驗(yàn)采用分光光度計(jì)校正法。

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